Báo cáo " TẠO PHÔI BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TRỨNG " ppt

tailieuhay_1489
tailieuhay_1489(15245 tài liệu)
(4 người theo dõi)
Lượt xem 11
2
Tải xuống
(Lịch sử tải xuống)
Số trang: 5 | Loại file: PDF
0

Gửi bình luận

Bình luận

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 14/03/2014, 09:20

Mô tả: Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT337TẠO PHÔI BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM TINHTRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TR ỨNGTrần Thị Thanh Khương, Đặng Hoàng Lâm, Phạm Văn Phúc, Phan Kim NgọcĐH Khoa học Tự nhiên TPHCMMỞ ĐẦUĐể nâng cao hiệu quả thụ tinh nhằm nhân nhanh đ àn bò sữa, việc áp dụng vitiêm (microinjection) tinh trùng vào bào tương tr ứng là cần thiết. Trứng bò thunhận từ nhiều nguồn được nuôi trưởng thành trong TCM 199 với 20% FBS (FetalBovine Serum). Tinh trùng bò sữa đông lạnh được hoạt hoá bằng phương phápswim-up trong môi trường BO. Sau khi vi tiêm, trứng được hoạt hoá. Sau 9 lầnthực hiện với 44 trứng tạo, đ ược 20 phôi, với tỷ lệ thành công là 47,17% và phôiđạt giai đoạn morula là 10%.ICSI - Intracytoplasmic sperm injection là phương pháp vi tiêm m ột tinh trùngđược lựa chọn từ trước đó vào bào tương trứng, với sự hỗ trợ của hệ thống vi thao táccùng với kính hiển vi đảo ngược. Kỹ thuật này ra đời vào năm 1992 do Palemo và cs đãứng dụng thành công trên người. ICSI như là một cuộc cách mạng trong hỗ trợ sinh sảnđặc biệt trong chữa trị vô sinh nam.Đối với gia súc, sau khi thực hiện ICSI, tế b ào trứng có chứa tinh trùng phải trảiqua quá trình hoạt hoá với các tác nhân như xung điện, ethanol 7%, Calcium Ionophore(A23187)…Tạo phôi bò bằng phương pháp vi tiêm đã mở ra hướng mới trong nhân giốngbò đem lại hiệu quả cao, đặc biệt l à bò sữa trong trường hợp nguồn giao tử có chấtlượng kém hoặc nguồn trứng đông lạnh. Bên cạnh đó, việc tiếp cận kỹ thuật hiệnđại còn giúp hoàn thiện các quy trình công nghệ khác trong các nghiên cứu xa nhưtạo dòng, sinh thiết, tạo động vật chuyển gen, bảo tồn động vật quý hiếm…VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPChuẩn bị trứng: Trứng bò tươi thu nhận tại lò mổ hay trứng đông lạnh đượclựa chọn, phân loại A, B. Các trứng n ày được nuôi trưởng thành trong môi trườngTCM 199 (Sigma) với 20% FBS (In vitrogen). Sau 24 giờ nuôi, tiến h ành phá lớptế bào cumulus bao quanh trứng bằng enzyme hyaluronidase (1mg/ml, Sigma).Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007338Hình 1. Trứng bò chín. (a) Trước khi phá lớp cumulus, (b) Sau khi phá lớp cumulusChuẩn bị tinh trùng: Tinh trùng đông lạnh trong cọng rạ được giải đông ở 37oC trong60 giây. Thực hiện swim-up 15 phút trong môi trường BO, thu nhận dịch nổi, chọn tinhtrùng cho vi tiêm.Vi tiêm: Hút tinh trùng bằng kim tiêm (injection pipette) trong giọt PVP (Invitrogen) chuyển qua giọt TCM 199 chứa trứng. Kim giữ (holding pipette) trứng đ ượcđiều chỉnh thể cực ở vị trí 6 giờ hay 12 giờ, tiến hành tiêm tinh trùng vào bào tươngtrứng một cách nhẹ nhàng, nhanh chóng với thể tích đưa vào bào tương trứng ít nhất.Hình 2. Vi tiêm tinh trùng vào bào t ương trứng(a)(b)Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT339Chuyển trứng sau khi vi tiêm vào môi trường nuôi phôi CR1aa. Sau 4 giờ nuôi, tiếnhành hoạt hoá trứng sau khi vi tiêm với TCM 199 với 7% ethanol trong 4 phút. Tiếp tụcnuôi phôi trong môi trường CR1aa và theo dõi các giai đoạn phát triển của phôi.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNSau 9 lần vi tiêm, được 44 trứng, số phôi thu được là 20 phôi, chiếm tỷ lệ tạo phôilà 47,17%. Trong 20 phôi có 2 phôi ở giai đoạn 2 tế bào (10%), 5 phôi giai đoạn 4 tếbào (25%), 10 phôi giai đoạn 8 tế bào (50%), 1 phôi giai đoạn 16 tế bào (5 %) và 2 phôigiai đoạn morula (10%).Hình 3. Kết quả tạo phôi bò bằng ICSI.(a) Phôi 2 tế bào, (b) Phôi 4 tế bào, (c) Phôi 8 tế bào, (d) Phôi morulaNăm 1989, Younis và cs đã tạo được phôi bò bằng kỹ thuật ICSI truyền thống vàtrứng không hoạt hóa với tỷ lệ 2%. Li v à cs (1999) tạo phôi bằng piezo-ICSI có hoạthóa bằng ethanol 7% phôi tạo ra với tỷ lệ 26,4%. Cùng năm đó Hamano đã thành côngvới tỷ lệ tương đối cao là 56,6 %. Năm 2004, Kato, H., Matsumoto và cs đ ã so sánhgiữa hoạt hóa bằng ethanol 7% và không hoạt hóa, đạt tỷ lệ phôi là 51% so với khônghoạt hóa là 13%. Takenaka và cs (2005) cùng dùng phương pháp hoạt hóa bằng ethanol7% với tỷ lệ tạo phôi là 75,6%.(a)(b)(c)(d)Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007340Như vậy với tỷ lệ tạo phôi là 47,17 % là tương đối cao, cao hơn hẳn với lần thựchiện đầu tiền vào năm 1989. So với các nghiên cứu gần đây thì tỷ lệ tạo phôi là tươngđối thấp, tuy nhiên các nhà khoa học trên thế giới thực hiện ICSI có hỗ trợ Piezo trongkhi chúng tôi thực hiện với phương pháp cổ điển, dùng lực cơ học của kim tiêm vàomàng trứng. Kỹ thuật Piezo-ICSI, màng pellucida và màng noãn sẽ chịu ít sự tác độngcủa đầu pipette mà thay vào đó là có sự hỗ trợ của tia piezo. Một trong những thuận lợicủa kỹ thuật piezo là giảm đáng kể sự phá hủy trứng trong suốt quá tr ình thụ tinh. Trongkhi với kỹ thuật cổ điển, lực của đầu kim gồm lực tiếp tuyến v à lực xoay đã phần nàotác động đến tế bào chất trứng.Như vậy, với kỹ thuật ICSI cổ điển chúng tôi đ ã tạo ra phôi với tỷ lệ 47,17% cùngvới sự hoạt hóa của ethanol 7%. Tuy ethano l7% không phải là tác nhân hoạt hóa nhântạo tối ưu nhưng tỷ lệ tạo phôi cũng tương đối cao. Hơn thế nữa, ethanol 7% là hóa chấtdễ có và tiện lợi trong điều kiện chúng tôiCó thể khẳng định rằng với nguồn mẫu ổn định, trứng chất l ượng tốt, hệ thống vithao tác tốt, ổn định cùng với tay nghề của kỹ thuật viên thao tác cao thì tỷ lệ phôi bòbằng phương pháp ICSI không chỉ dừng ở tỷ lệ 47,17% mà còn cao hơn nữa.Đối với trứng người, tỷ lệ ICSI cao hơn so với IVF, nhưng ở bò: theo Kim teaChung và cs (1999) tỷ lệ phôi IVF là 75%, của Phan Kim Ngọc và cs (2006) là 72,19%tỷ lệ tạo phôi bằng ICSI thấp hơn do bản chất của trứng bò khó hoạt hóa hơn so vớitrứng người và để tạo thành hợp tử, chúng phải nhận những kích thích nhân tạo. Tuynhiên, Gyu-Jin Rho và cs (1998) đã tiến hành xác định giới tính tinh trùng bằng phươngpháp Flow Cytometry với tỷ lệ 80% và tiến hành vi tiêm tinh trùng đã xác định giớitính. Tỷ lệ phôi đạt được với phương pháp này là 46,6% và phôi ở giai đoạn blastocystlà 6,9%. So với kết quả tạo phôi của chúng tôi là 47,17 % cao hơn.KẾT LUẬNTrong phương pháp chuẩn bị giao tử, swim-up dùng cho hoạt hoá tinh trùng phùhợp với ICSI. Tác nhân ethanol 7% có vai tr ò hoạt hoá trứng sau khi vi tiêm, cho kếtquả tạo phôi tương đối cao và phù hợp với điều kiện thực hiện. Bằng kỹ thuật ICSI cổđiển, với tác nhân hoạt hoá là ethanol 7% tỷ lệ tạo phôi 47,17% với phôi đạt giai đoạnmorula là 10%.TÀI LIỆU THAM KHẢO1. Carlos A. Guerrero. (2006) Cryopreservation And Intracytoplasmic SpermInjection With Bovine Epididymal Spermatozoa . .S. Louisiana State University.2. Henry E. Malter & Jacques Cohen.(2002) Intracytoplasmic sperm injection:technical aspects. Gamete source, manipulation and disposition.3. Heuwieser W, Yang X, Jiang S, Foote RH: Fertilization of 21. Yanagida K,Katayose H, Yazawa H, et al(1992): Successful fertilizabovine oocytes aftermicrosurgical injection of spermatozoa TheriogenologyPhần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT3414. Jin-Tae Chung (1999). Activation of bovine oocytes following intracytoplasmicsperm injection (ICSI). Department of Animal Science Macdonald Campus McGillUniversity, Montreal, Quebec, Canada.5. Keith J. Betteridge (2004). New reproductive Technologies in Cattle: A VeterinaryPerspective. Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College,University of Guelph, Guelph, Ontario, N1G 2W1, Canada.6. Kimura, Y & R. Yanagimachi (1995). Intracytoplasmic sperm injection in themouse. Biol. Reproduction. 52: 709-720.7. Mapletoft RJ & J. F. Hasler (2005). Assisted reproductive technologies in cattle: areview. (1) Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan,Saskatoon, SK S7N 5B4, Canada (2) AB Technology, Bionich e Animal HealthUSA, Inc., Pullman, WA 99163, United States of America.8. Ragaa Mansour (1998). Intracytoplasmic sperm injection: a state of the arttechnique Human Reproduction Update, Vol. 4, No. 1 pp. 43-56.9. Toshitaka Horiuchi (2002) Application of Intracytoplasmic Sperm Injection toAnimal Production. Faculty of Life and Environmental Sciences Department ofLife Sciences.SUMMARYBovine embryo production by intracytoplasmic sperminjectionTran Thi Thanh Khuong, Dang Hoang Lam, Pham Van Phuc, Phan Ki m NgocUniversity of Sciences HCMCityDue to bovine oocyte source is rare. To increase fertilization effect, application ofintracytoplasmic sperm injection method is nessesary. In our research, bovine oocytesare collected at slaughter-house and cultured with TCM 199 plus 20% FBS (fetal bovineserum) until maturation. Cryopreserved bovine semen is thawed and activated with BOmedium. After injection, oocytes are treated with 7% ethanol in TCM 199 for 4 min foractivation. In 9 repeats, 44 oocytes were in jected, with 20 embryo that are formed, with47,17% cleavage rate, 10% morula embryo. . Kết quả tạo phôi bò bằng ICSI.(a) Phôi 2 tế bào, (b) Phôi 4 tế bào, (c) Phôi 8 tế bào, (d) Phôi morulaNăm 1989, Younis và cs đã tạo được phôi bò bằng kỹ. vào bào tương trứng ít nhất.Hình 2. Vi tiêm tinh trùng vào bào t ương trứng (a)(b)Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT339Chuyển trứng sau khi vi tiêm

— Xem thêm —

Xem thêm: Báo cáo " TẠO PHÔI BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TRỨNG " ppt, Báo cáo " TẠO PHÔI BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TRỨNG " ppt, Báo cáo " TẠO PHÔI BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TRỨNG " ppt

Lên đầu trang

Tài liệu liên quan

Từ khóa liên quan

Đăng ký

Generate time = 0.113372802734 s. Memory usage = 13.9 MB